5％脱脂奶粉/ TBST，CST建议在室温下封闭1小时。
2）
由于一抗的稀释度大于参考抗体的稀释度，因此建议在4°C下孵育过夜。
3）
用5％脱脂奶粉/ TBST稀释二抗。工作浓度不太高，在室温下孵育1小时。
4）
用1XTBST缓冲液彻底清洗。
有两种情况用于具体分析。
实验条件：检测目标磷酸化Akt（Ser473）。抗体用途：CST＃4060 SPhospho-Akt（Ser473）（D9E）mAb XPRabbit;细胞系：MCF7。
问题：显示非特定的波段。
Phospho-Akt（Ser473）（绿色）检测到两个谱带。一个具有约60 kd的预期分子量，另一个具有稍大的分子量，并且两个谱带强度相同。
红色荧光是微管蛋白，一种内部参考蛋白。
解决方案：鼓励客户以较少的传代次数重新填充细胞。重新刺激和裂解后，获得单个条带。
问题分析：AKT激酶由分子量非常相似的三种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成：AKT1，AKT2和AKT3。
在正常条件下，Phospho-Akt（Ser473）必须只有一个条带，但是在某些条件下，AKT会进行糖基化，泛素化和其他修饰以改变蛋白质大小。会导致它。
在这种交流情况下，客户发现使用的细胞系超过25代，因此同一抗体再次与少数健康细胞一起使用，最终形成一条带。
该国许多教师细胞传代不能准确记录传代数，因此许多教师不知道细胞世代数，因此，如果这些细胞系的蛋白质表达谱发生变化，这些即使看到细胞系，其他细胞的影响和支原体污染等问题也是未知的。
因此，建议教师注意细胞系培养，定期检查细胞污染，控制传代次数，并仅使用健康细胞以确保可靠的实验。
我们建议您阅读以下内容，以了解支原体污染蛋白条带的影响。
你不知道WB能生长细胞吗？
我们先输了！
这个有趣的案例来自北京大学医学院生命科学中心研究组尹玉欣教授在2017年Nature Communications发表的一篇文章中。
作者首先使用全长PTEN抗体检测比PTEN稍小的条带，并且条带表达模式与PTEN相似（图2）。
a）
如果作者认为该条带是对抗体的非特异性识别，并且不会进行下一个详细研究，则没有如此大的文章。
当时，作者使用了CST＃9559PTEN（138G6）RabbitmAb抗体，该抗体在精神刺激下只能识别PTENC末端域（图2）。
b）识别N末端PTEN抗体（图2）。
c）在不同癌细胞系中进行检测，通过质谱进一步分析和验证，确认看到的第一个条带是PTEN样N端PTofisoform。PTEN蛋白家族及其功能多样性获得了更深入的了解。
